酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作要點

　　以下是天正信達生物闡述酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的核心操作要點及注意事項：

　　一、實驗前準備

　　材料選擇‌

　　優(yōu)先選用聚苯乙烯96孔板作為固相載體

　　酶標二抗建議選擇HRP或AP標記型

　　光敏感試劑(如TMB底物)需避光保存

　　樣本處理‌

　　血清樣本需避免溶血(紅細胞破裂會干擾HRP活性)

　　組織樣本建議按1:5(w/v)比例用PBS勻漿后過濾

　　二、關鍵操作流程

　　包被階段‌

　　抗原/抗體稀釋濃度通常為1-10μg/mL(碳酸鹽緩沖液pH9.6)

　　4℃過夜或37℃孵育2小時，確保均勻吸附

　　封閉處理‌

　　推薦使用5% BSA或脫脂奶粉溶液，200μL/孔封閉1-2小時

　　封閉后需用PBST(含0.05% Tween-20)洗滌3-5次

　　加樣規(guī)范‌

　　加樣時需對準孔底，避免氣泡或液體濺出

　　樣本建議進行梯度稀釋(如2倍系列稀釋)

　　孵育條件‌

　　嚴格控制溫度(室溫或37℃)及時間(1-2小時)

　　建議使用軌道震蕩儀(500±50rpm)提高結合效率

　　顯色與終止‌

　　TMB底物反應時間控制在5-30分鐘(觀察顯色強度)

　　HRP系統(tǒng)終止使用2M硫酸，AP系統(tǒng)用NaOH

　　三、質量控制要點

　　項目‌ ‌要求‌

　　洗滌‌ 每次注滿200μL洗滌液，拍干

　　對照組‌ 必須包含陰性/陽性對照及空白孔

　　數(shù)據(jù)讀取‌ 顯色后15分鐘內完成OD值檢測

　　注：實驗全程需佩戴手套，移液槍需定期校準

　　以上資料僅供參考，具體請咨詢技術老師或供應商。

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