實驗操作常見問題與解決方案

　　1. 背景信號過高(高背景)

　　這是最常見的問題之一，可能導致結果不準確。

　　原因：非特異性結合。

　　解決方案：

　　充分洗滌：每一步反應后都要充分洗滌，去除未結合的分子。

　　優化封閉條件：使用合適的封閉液(如BSA、脫脂奶粉、血清)，并確保封閉時間足夠(通常1-2小時，37°C)。

　　優化抗體濃度：抗體濃度過高會導致非特異性結合。必須進行抗體滴定實驗，找到最佳工作濃度。

　　樣品純度：確保樣品中無雜質，必要時進行純化或稀釋。

　　2. 信號弱或無信號

　　原因：關鍵試劑失效或步驟錯誤。

　　解決方案：

　　檢查試劑：確認抗體、酶、底物是否在有效期內，是否正確保存(避免反復凍融)。

　　確認實驗流程：是否漏加了某種試劑?反應時間是否足夠?

　　檢查酶標儀：儀器功能是否正常?

　　抗原修復：對于某些固定過的組織樣本或包被的抗原，可能需要進行抗原修復以暴露表位。

　　3. 孔間重復性差(CV值高)

　　原因：操作不一致。

　　解決方案：

　　熟練操作：加樣時手法要穩定，使用多通道移液器并定期校準。

　　混勻均勻：在加樣前，確保所有試劑和樣品充分混勻。

　　避免邊緣效應：孵育時使用封板膜，防止蒸發;孵育箱溫度要均勻。

　　4. 標準曲線效果不好(R2 < 0.99)

　　原因：標準品稀釋不準或降解。

　　解決方案：

　　精確稀釋：使用經過校準的移液器和吸頭，采用系列稀釋法。

　　新鮮配制：標準品最好現用現稀釋，避免長時間放置。

　　復查數據：檢查是否有異常點，必要時重做該濃度點。

　　三、數據分析與結果解讀

　　1. 如何繪制標準曲線?

　　以標準品濃度為橫坐標(X軸)，對應的吸光度(OD值)為縱坐標(Y軸)。通常使用四參數邏輯(4-PL)曲線擬合(常用)或對數-直線擬合，軟件會自動完成并給出擬合度(R2)和曲線方程。根據樣品的OD值，代入方程即可計算出其濃度。

　　2. 樣品濃度超出標準曲線范圍怎么辦?

　　必須稀釋后重測。直接使用曲線外推的數據是不可靠的。將樣品進行適當倍數稀釋(如10倍、100倍)，使測出的OD值落在標準曲線的線性范圍內，最后計算濃度時再乘以稀釋倍數。

　　3. 陰性對照也有信號?

　　陰性對照通常會有非常微弱的信號(本底信號)，這是正常的。只要其信號值顯著低于陽性對照或樣品孔即可。如果陰性對照信號很強，說明存在非特異性結合或污染，需要排查原因。

　　四、其他實用技巧與注意事項

　　試劑回溫：所有試劑在使用前應恢復到室溫(約20-25°C)，尤其是洗滌液，冷的洗滌液可能導致非特異性結合。

　　避免污染：使用干凈的吸頭，不要交叉污染不同濃度的標準品或樣品。

　　控制時間：底物顯色反應對時間敏感，要嚴格控制顯色時間，并在加入終止液后盡快讀數。

　　記錄細節：詳細記錄所有試劑批號、濃度、孵育時間等，便于結果追溯和問題排查。

　　綜上，說明書標曲在嚴格匹配實驗條件時可作為參考，但實際應用中需結合樣本特性進行驗證或調整?。

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