ELISA實驗全流程問題排查手冊

　　我們將問題分為三大類：① 信號問題、② 背景問題、③ 標準曲線/數據問題。

　　一、 信號問題

　　1. 無信號或信號太弱

　　可能原因及解決方案：

　　試劑問題：

　　抗體失活或錯加漏加： 確認一抗、二抗或檢測抗體(間接法)是否有效。檢查抗體保質期，并確保添加了正確的抗體。每次實驗前，短暫離心抗體管，確保試劑全部集中在管底。

　　酶失活： 檢查HRP等酶標記物是否因保存不當(如反復凍融、接觸疊氮鈉)而失活。

　　底物失效： TMB底物應無色透明，若已變藍則說明失效。需避光保存，現用現配。

　　樣本問題：

　　目標蛋白濃度過低： 樣本中待測物含量低于檢測下限。可嘗試濃縮樣本或換用更高靈敏度的ELISA試劑盒。

　　樣本保存不當： 反復凍融或長期保存于-20℃(而非-80℃)可能導致蛋白降解。確保樣本分裝保存，避免反復凍融。

　　樣本基質干擾： 血清、血漿中的干擾物質(如溶血、脂血)可能影響。可適當稀釋樣本或對樣本進行預處理(如高速離心去除沉淀)。

　　操作問題：

　　孵育時間/溫度不足： 嚴格遵循說明書推薦的孵育時間和溫度(通常是37℃ 1小時或4℃過夜)。

　　洗板過于劇烈： 洗板次數過多或沖力過猛，將包埋的抗原或結合的抗體洗脫。遵循說明書的洗滌次數和程序，保持洗板機噴嘴通暢，手工洗板時動作要輕柔。

　　封板膜不嚴： 孵育時蒸發導致邊緣孔變干，有效濃度升高，而中心孔濃度正常，出現“邊緣效應"。確保使用高質量的封板膜，并密封孔板。

　　移液誤差： 定期校準移液器，確保加樣體積準確。吸取粘稠液體(如血清)時最好使用反向吸液法。

　　2. 信號過強(超出標準曲線最高點)

　　可能原因及解決方案：

　　樣本濃度過高： 這是最常見的原因。必須對樣本進行預實驗摸索稀釋倍數! 找到一個使OD值落在標準曲線中段的稀釋度。

　　孵育時間過長或溫度過高： 嚴格計時，避免過度孵育。

　　酶標二抗濃度過高： 如果是自己組建的ELISA體系，需滴定優化二抗濃度。

　　底物顯色時間過長： TMB顯色反應需及時終止(加終止液)。一旦標準曲線最高點顏色足夠深，應立即終止。

　　二、 背景問題

　　現象： 陰性對照、空白孔也有較高的吸光度值。

　　可能原因及解決方案：

　　洗滌不充分： 這是高背景的首要元兇!確保洗滌緩沖液配制正確(如鹽離子濃度)，洗滌次數和體積要足夠，每次洗滌后都要在吸水紙上拍干殘留液體。

　　封閉不凈：

　　更換封閉劑(常用BSA、脫脂奶粉、血清等)，找到適合您體系的封閉液。

　　增加封閉液濃度或延長封閉時間。

　　非特異性結合：

　　抗體交叉反應： 確保使用的一抗和二抗特異性好，且種屬匹配。例如，檢測小鼠樣本，二抗應為抗小鼠的，且一抗不能來源于小鼠。

　　抗體濃度過高： 滴定優化一抗和二抗的工作濃度。

　　試劑污染： 所有試劑和容器都要確保干凈，避免交叉污染。

　　底物顯色時間過長： 同“信號過強"原因。

　　酶標板問題： 使用了非ELISA專用的極板，吸附能力不均一。

　　三、 標準曲線與數據問題

　　1. 標準曲線不佳(線性差/R2值低)

　　標準品問題：

　　標準品復溶不當：未溶解或混勻不充分。復溶前先離心，加入稀釋液后輕柔地吹打或渦旋混勻，避免起泡。

　　標準品反復凍融：必須分裝保存，每支只用一次。

　　稀釋錯誤：進行倍比稀釋時，每步都要換新槍頭，并充分混勻。

　　移液誤差： 標準曲線的準確性極度依賴精確的移液。務必使用校準過的移液器和高質量的槍頭。

　　孵育時間不一致： 標準品孔和樣本孔應同時加樣、孵育和顯色，以保證反應條件一致。

　　2. 重復性差(孔間差異大)

　　操作不一致： 不同操作者或同一次實驗的不同時間點，手法不一致。盡量由同一人完成全部操作。

　　洗板不均： 洗板機堵塞導致某些孔洗滌不充分/過于劇烈。每次實驗前檢查洗板機所有通道是否通暢。

　　移液誤差： 同上，確保加樣精確。

　　板底不潔： 讀板前，用無塵紙仔細擦拭板底，去除指紋、水漬或灰塵。

　　通用黃金法則與建議

　　尊重說明書： 實驗時，嚴格遵循試劑盒說明書的每一步，不要隨意更改流程、時間和溫度。

　　設立對照： 每一次實驗都必須包含：

　　空白孔： 只有底物和終止液，用于調零。

　　陰性對照：不含目標蛋白的樣本基質，用于評估背景。

　　陽性對照 ：已知濃度的標準品或樣本，用于驗證實驗有效性。

　　精心準備：

　　提前規劃： 將所有試劑從冰箱取出，平衡至室溫(除非說明書要求低溫操作)，減少溫度帶來的誤差。

　　充分混勻： 所有液體試劑使用前都輕輕搖勻。

　　“預實驗"摸索： 對于未知濃度的樣本，一定要做梯度稀釋預實驗，找到合適的稀釋倍數。

　　做好記錄： 詳細記錄每一批試劑的批號、實驗日期、操作人員、任何與說明書不一致的細節等，便于出了問題追溯原因。

　　總結一下，當您遇到問題時，可以按照以下步驟排查：

　　回顧實驗記錄，確認操作無誤。

　　檢查試劑：是否在效期內?是否正確保存?是否漏加?

　　重點檢查洗滌和孵育步驟，這兩個是問題的重災區。

　　分析標準曲線：如果標準曲線很好，問題很可能出在樣本;如果標準曲線也很差，問題則出在公共環節(如試劑、操作、洗板等)。

　　注：以上僅供參考，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。 Elisa試劑盒

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