RNA逆轉錄試劑盒操作步驟及實驗原理

　　RNA逆轉錄實驗原理

　　RNA逆轉錄是通過逆轉錄酶將RNA模板(如mRNA)轉化為互補DNA(cDNA)的過程，其核心原理是逆轉錄酶以RNA為模板，在引物(如Oligo dT或隨機引物)引導下合成cDNA鏈?。該技術廣泛應用于基因表達分析、病毒檢測等領域，其關鍵步驟包括：

　　引物結合?：Oligo dT引物結合mRNA的Poly(A)尾，或隨機引物結合RNA任意區域?。

　　cDNA合成?：逆轉錄酶在42-50℃下催化dNTPs聚合，形成cDNA鏈?。

　　酶失活?：高溫(85℃)終止反應，防止酶活性干擾后續實驗?。

　　試劑盒操作步驟

　　以常見試劑盒為例，操作流程如下：

　　1. ?RNA準備?

　　質量檢測?：通過電泳確認RNA完整性(28S/18S條帶比例2:1)?。

　　去基因組DNA?：使用DNase處理RNA，避免gDNA污染?。

　　2. ?反應體系配制?

　　冰上操作?：防止RNA降解?。

　　加樣順序?：

　　加入RNA模板(100pg-2μg)?。

　　加入逆轉錄酶、dNTPs及緩沖液(比例參考試劑盒說明)?。

　　輕彈混勻后瞬離，避免氣泡?。

　　3. ?逆轉錄程序?

　　退火?：25℃孵育5分鐘(引物結合)?。

　　延伸?：42℃反應15-60分鐘(cDNA合成)?。

　　酶失活?：85℃加熱5分鐘終止反應?。

　　4. ?產物保存?

　　cDNA可短期保存于-20℃，長期保存于-80℃?。

　　注意事項

　　RNA質量?：降解或污染的RNA會導致cDNA產量低?。

　　引物選擇?：

　　Oligo dT適用于真核mRNA，隨機引物適用于原核或降解RNA?。

　　溫度控制?：復雜RNA(如高GC含量)需65℃預變性5分鐘?。

　　常見問題解決

　　cDNA濃度低?：檢查RNA完整性或增加模板量?。

　　gDNA污染?：使用DNase處理或設計跨外顯子引物?。

　　通過上述步驟和原理，可高效完成RNA逆轉錄實驗，為后續PCR或qPCR提供可靠模板?。

　　注：以上僅供參考，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。

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