科研檢測pcr試劑盒使用方法

　　PCR試劑盒使用方法

　　1. ?實驗前準備?

　　環境消毒?：實驗室需提前用紫外線照射30分鐘，確保無菌環境?。

　　工具準備?：冰盒、離心機、移液器、滅菌PCR管等需提前備齊，操作時佩戴手套和口罩?。

　　試劑檢查?：確認試劑盒在有效期內，核對組分是否齊全(如2×Taq Mix、引物、dNTPs等)?。

　　2. ?反應體系配制?

　　試劑解凍?：除酶組分外，其他試劑室溫靜置10分鐘融化;酶制劑需冰上短暫解凍后輕彈混勻?。

　　加樣順序?(以25μL體系為例)：

　　2×Taq Mix 12.5μL

　　引物各1μL(多重PCR時總量≤3μL)

　　模板DNA 2μL(濃度50-200ng/μL，A260/A280=1.8-2.0)

　　補足ddH?O至25μL?。

　　注意事項?：配制過程需在冰上進行，避免反復凍融試劑?。

　　3. ?PCR程序設置?

　　預變性?：95℃ 5分鐘，確保DNA雙鏈分離?。

　　循環參數?：

　　變性：95℃ 30秒

　　退火：50-65℃(根據引物Tm值調整，建議比Tm低3-5℃)30秒

　　延伸：72℃(1kb/min計算時間)?。

　　循環次數?：25-35次(高GC模板可增至40次)，最終延伸72℃ 5分鐘?。

　　4. ?結果檢測?

　　電泳分析?：取10-20μL產物，1%瓊脂糖凝膠電泳(40-60V，30-40分鐘)，與DNA Marker對比條帶大小?。

　　對照設置?：必須包含陰性對照(無模板)和陽性對照(已知模板)?。

　　5. ?常見問題處理?

　　無擴增產物?：檢查引物特異性(BLAST驗證)、模板質量或稀釋模板重試?。

　　非特異性條帶?：優化退火溫度或使用熱啟動酶?。

　　注意事項

　　引物設計?：長度15-28堿基，GC含量40%-60%，避免3'端連續G/C?。

　　酶選擇?：高GC模板建議使用熱啟動酶(如Taq HS)?。

　　污染控制?：不同批次試劑需測試，移液槍定期校準?。

　　注：以上僅供參考，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。

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