小鼠Ⅱ型前膠原羧基端原肽(PIICP)試劑盒 貨號：FXs06793

　　可售賣地：全國　　供貨：現貨供應

　　保?質?期：半年　　品牌：分細生物

　　保存溫度：2-8℃

　　種屬：小鼠 / Mouse　　簡索英文：PIICP Elisa KIT規　　格：48T / 96T特

　　色服務：免費代測 / 免費提供技術支持　　用途：僅供科研使用　　檢測樣本：血清，血漿，組織，相關液體等

檢測原理 :

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ ELISA）。在預包被 小鼠Ⅱ型前膠原羧基端原肽(PIICP)止抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入 小鼠Ⅱ型前膠原羧基端原肽(PIICP) 校準品和待測樣本，再加入另一株 HRP標記的抗 小鼠Ⅱ型前膠原羧基端原肽(PIICP) （酶標抗體），經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體 -抗原-酶標抗體的夾心復合物。加底物 A和 B，底物在 HRP催化下，產生藍色產物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉化為黃色，在酶標儀  450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中 小鼠Ⅱ型前膠原羧基端原肽(PIICP)的濃度正相關。擬合校準品曲線，可以計算出樣本中 小鼠(PIICP)的濃度。

所需器材和試劑

1、 酶標儀 (波長 450nm 濾光片)

2、37°C  恒溫箱(不推薦使用細胞用 CO2 培養箱)

3、 自動洗板機或多道移液器 /5ml 滴管(手工洗板用)

4、 無菌的 EP 管及一次性吸頭

5、 精密的單道 (0.5-10μL, 5-50μL, 20-200μL,  200-1000μL)和多通道移液器(移液器使用前需校準)。

6、吸水紙及加樣槽

7、去離子水或蒸餾水

試劑盒組成：

標本收集 :

1、收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。

2、 血漿抗凝劑推薦使用 EDTA 。避免使用溶血，高血脂標本。

3、標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。

4、 標本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于 -20 ℃ , -70 ℃電冰箱內，避免反復凍融，3-6月內檢測。

5、 如果您的樣本中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況， 做適當倍數稀釋 (建議做預實驗，以確定稀釋倍數)。

儲存條件：

樣品采集及保存：

1、 血清全血樣本室溫放置 2小時或 2-8°C 過夜。1000×g 離心20分鐘，取上清。可立即檢測，或按一次使用量分裝凍存于-20°C  或-80°C。

2、 血漿抗凝劑推薦使用 EDTA-Na2/K2，樣品采集后30分鐘內于2-8°C，1000×g 離心15分鐘，取上清。可立即檢測，或按一次使用量分裝凍存于-20°C  或-80°C。其他抗凝劑的使用及選擇請查看樣品制備指南。

3、組織樣本組織樣本一般制成組織勻漿，處理方法如下：
3.1、 將目標組織置于冰上，用預冷的 PBS緩沖液(0.01M，pH=7.4)洗滌去除殘留的血液，稱重后備用。

3.2、 在冰上用裂解液研磨組織勻漿。加入裂解液的體積取決于組織的重量，一般情況每 1g 組織碎片使用9ml裂解液。另外建議在裂解液中加入蛋白酶抑制劑，如 1mM PMSF。

3.3、 可再利用超聲破碎或反復凍融進一步處理 (超聲破碎過程中，需冰浴降溫；反復凍融法可重復2次)。

3.4、 將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。或按一次使用量分裝凍存于-20°C 或-80°C。

3.5、 根據實驗需要，組織勻漿樣本可先測定總蛋白濃度 ,以便于數據分析，推薦 BCA 法。一般調整總蛋白濃度至 1-3mg/ml 用于 ELISA  檢測。某些組織樣本，如肝臟，腎臟，胰腺因含有較高濃度的內源性過氧物酶, 在樣品濃度較高的情況下會和顯色底物反應，出現假陽性。可嘗試使用 1%H2O2 滅活  15min 再檢測。

注意： 裂解液常用 PBS 緩沖液，或使用中等強度 RIPA 裂解液。使用 時，PH 值需調整為PH7.3，避免使用含 NP-40，Triton X-100 和  DTT 的組分，會嚴重抑制試劑盒工作。推薦使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH  7.3，可自行配制或聯系我們購買。

4、 細胞培養上清收集上清液， 2-8°C，2500rpm 離心 5min，收集澄清的細胞培養上清。立即用于檢測，或按一次使用量分裝于-80°C  凍存備用。

5、細胞裂解液

5.1、 懸浮細胞的收集及裂解： 2-8°C，2500rpm 離心 5min，收集細胞。再加入預冷的 PBS 輕輕混勻清洗，2-8°C，2500rpm 離心  5min，收集細胞。加入 0.5-1ml 細胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(如 PMSF，工作濃度 1mmol/L)，置于冰上，裂解 30min-1h ,  或者配合超聲波破碎。

5.2、 貼壁細胞的收集及裂解：吸走上清液，加入預冷的 PBS 洗三次。加入 0.5-1ml 細胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(如PMSF，工作濃度  1mmol/L)，用細胞刮輕輕刮下貼壁細胞。細胞懸液轉入離心管中，置于冰上，裂解 30min-1h，或者配合超聲波破碎。

5.3、 細胞裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動離心管，使蛋白充分裂解 , 出現黏糊狀是 DNA，可以使用超聲波破碎DNA。(或用超聲波 3-5mm 探頭，功率 150-300W, 冰上超聲處理樣品，工作 1-2  秒，停止 30 秒， 3~5 個循環。)

5.4、 裂解或超聲破碎完成， 2-8°C，10000rpm 離心 10min，上清移入 EP 管中，立即用于檢測，或按一次使用量分裝于-80°C  凍存備用。

注意：注意事項同組織樣本。

6、 其他生物樣本 2-8°C，1000×g 離心樣品 20 分鐘。收集上清液立即用于檢測，或按 一次使用量分裝于-80°C  凍存備用。

操作步驟：

步驟 1： 向孔中加入 100ul 標準品或待測樣品，貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 90 分鐘。

洗板： 洗板 2 次。不浸泡。

步驟 2： 加入 100ul sws-抗體工作液，貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 60 分鐘。

洗板： 洗板 3 次。每次浸泡 1 分鐘。

步驟 3： 加入 100ul HRP-鏈霉親和素(SABC)工作液，貼上覆膜，37°C 靜置孵育 30 分鐘。

洗板： 洗板 5 次。每次浸泡 1 分鐘。

步驟 4： 添加 90ul TMB 顯色底物。貼上覆膜， 37°C 靜置孵育 10-20 分鐘(請使用 TMB  顯色精準控制方法)。

步驟 5： 添加 50ul 反應終止液。立即在 450nm 處讀取 OD450 值并計算。

小鼠Ⅱ型前膠原羧基端原肽(PIICP)試劑盒