RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟及原理

　　RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟?：

　　?實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備?：

　　確保RNA的完整性和純度，避免降解和污染?。

　　準(zhǔn)備RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、無(wú)酶無(wú)菌水、移液槍、配套去酶槍頭、無(wú)酶EP管等實(shí)驗(yàn)材料?。

　　?去基因組DNA?：

　　在提出的RNA中加入DNA酶，然后加無(wú)酶無(wú)菌水，用移液器充分混勻。具體操作為：RNA 100pg~2μg(根據(jù)濃度計(jì)算)，DNA酶 2μL，無(wú)酶無(wú)菌水加至16μL，室溫(25℃左右)反應(yīng)5分鐘，然后置于冰上備用。

　　?逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制?：

　　根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將所需的組分如Buffer、Enzyme、Nuclease-free Water等按照體積配制反應(yīng)Mix?。

　　?進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)?：

　　將RNA樣品與配制好的反應(yīng)Mix混合，設(shè)置適當(dāng)?shù)臏囟群蜁r(shí)間條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。常見(jiàn)的反應(yīng)條件包括42℃反應(yīng)15分鐘等，反應(yīng)結(jié)束后可以得到cDNA?。

　　?產(chǎn)物處理?：

　　反應(yīng)結(jié)束后，立即將EP管放于冰上備用，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以在-80℃下長(zhǎng)期保存，或者稀釋后用于后續(xù)的qPCR等實(shí)驗(yàn)。

　　?RNA逆轉(zhuǎn)錄原理?：

　　RNA逆轉(zhuǎn)錄是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。其原理是利用逆轉(zhuǎn)錄酶，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，以脫氧核糖核苷酸為底物，以寡居dT為引物，把mRNA轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA。由于該酶的效果與中心法則(DNA所承載的生物信息表達(dá)順序應(yīng)該是DNA-RNA-蛋白)順序相反，故而有“逆轉(zhuǎn)錄"之稱?4。

　　在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，首先一條寡聚脫氧核苷酸引物與RNA雜交，然后由RNA依賴的DNA聚合酶催化合成相應(yīng)的互補(bǔ)cDNA拷貝。這個(gè)拷貝可以用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)。

　　以上操作步驟和原理僅供參考，具體需根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。

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