ELISA夾心法實驗步驟和注意事項

　　以下是天正信達ELISA夾心法實驗步驟及注意事項的詳細說明：

　　一、實驗步驟?

　　抗體包被?

　　用pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋捕獲抗體至1-10μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被過夜(或37℃ 2小時)。

　　棄去孔內液體，用洗滌液(含0.1%吐溫的PBS)洗板3次，每次3分鐘，拍干。

　　封閉?

　　加入3% BSA或5%脫脂牛奶的封閉液200μl/孔，37℃孵育1小時，封閉非特異性結合位點。

　　洗板3次，方法同前。

　　加樣與孵育?

　　加入待測樣本或標準品100μl/孔，37℃孵育1小時(復雜樣本可延長至2小時)。

　　設置空白孔、陰性對照孔和陽性對照孔。

　　酶標抗體結合?

　　洗板后加入HRP標記的檢測抗體100μl/孔，37℃孵育1小時。

　　洗板5次，去除未結合抗體。

　　顯色與終止?

　　加入TMB底物溶液100μl/孔，避光反應15-30分鐘(觀察顯色程度)。

　　加入50μl 2Mls終止反應，顏色由藍變黃。

　　檢測?

　　終止后15分鐘內用酶標儀測定450nm處OD值(參考波長630nm)。

　　二、關鍵注意事項?

　　樣本處理?

　　血清樣本需離心去除纖維蛋白，避免溶血;組織勻漿需充分裂解后離心取上清。

　　NaN3會抑制HRP活性，避免使用含NaN3的樣本或緩沖液。

　　溫度控制?

　　所有試劑使用前需平衡至室溫(20-25℃)，避免溫度差異導致反應速率不均。

　　孵育時用不干膠密封板孔，防止蒸發。

　　洗滌操作?

　　手工洗板需垂直拍板，避免交叉污染;自動洗板機需檢查洗液管路是否堵塞。

　　洗滌后立即加下一步試劑，避免孔板干燥。

　　質量控制?

　　陽性對照OD值應≥0.8，陰性對照OD值≤0.2，否則實驗無效。

　　建議做雙復孔，減少操作誤差。

　　試劑保存?

　　未開封試劑盒2-8℃保存;濃縮洗滌液結晶需37℃溶解后使用。

　　TMB底物需避光保存，現配現用。

　　三、常見問題解決?

　　高本底值?：檢查封閉是否充分，可延長封閉時間或更換封閉劑(如改用5%脫脂牛奶)。

　　顯色過弱?：確認酶標抗體活性及孵育時間，避免顯色底物失效。

　　孔間差異大?：校準移液器，加樣時避免氣泡或孔壁殘留。

　　如需具體試劑盒參數，請參照產品說明書。

　　注：以上資料僅供參考，不作為實際標準，具體請咨詢技術老師。

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