產品信息

產品描述

     本產品miRNA鏈合成試劑盒采用Poly(A)加尾法原理，首先在miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用 Anchored oligo(dT)-universal tag 通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應，在逆轉錄酶的作用下生成 miRNA 對應的鏈cDNA。本產品使用特殊優化預混合 miRNA RT Enzyme Mix 將 Poly(A)加尾和逆轉錄合并為一步完成，大大簡化了操作步驟并提高 Poly(A)加尾和逆轉錄效率， 本產品可從20pg-2μg 的 Total RNA 中有效制備 miRNA 對應的鏈cDNA。

產品用途

用于miRNA對應cDNA鏈的合成。本產品可從20pg-2μg 的 Total RNA 中有效制備 miRNA的cDNA。

本產品需與HRbio™ miRNA qPCR Kit miRNA熒光定量PCR試劑盒配套使用。

產品組分

運輸和保存方法

干冰運輸。-20℃保存，避免反復凍融，有效期1年。

使用方法

miRNA 3’末端進行Poly (A)加尾和逆轉錄反應（鏈合成）

1.解凍2×miRNA RT Reaction Mix并混勻，miRT Enzyme Mix放于冰中備用，加入以下試劑至總體積20μl(注意：最后加入miRNA RT Enzyme Mix)

2.移液器輕輕混勻上述配制的反應液，短暫離心后在42°C反應60 min。

3.85°C加熱5秒鐘失活miRNA RT Enzyme Mix。

4.合成的cDNA反應液可放置于-20°C保存；也可以直接進行下游PCR或者熒光定量PCR檢測。

miRNA逆轉錄試劑盒(加尾法）

注意事項

1）miRNA RT Enzyme Mix比較粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導致損失，用前請點甩離心，并且避免吸頭外壁沾附損失。Enzyme Mix內酶都是過量的，即使每次按照 1.8μl使用，也不影響使用效果。

2）在反應中使用的total RNA 必須包含有小分子RNA(miRNA)。此過程也可以使用富集的miRNA， 單純miRNA無法直接用分光光度計定量，建議直接加入2μl ~5μl。可根據目的miRNA豐度決定加入量，但是對于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入體積8 μl。

3）按照上述操作步驟得到的cDNA模板用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測時，可以根據實際情況選擇使用量，對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA 模板易導致非特異性擴增，可根據所檢測miRNA 的豐度適當的稀釋cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果發現有非特異擴增條帶，或者溶解曲線顯示有非特異擴增，往往提示cDNA模板過量， 可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用。

4）本產品僅作科研用途！